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猪细小病毒病的流行现状、诊断与疫苗 亿万先生手机版 来源:新大牧业 王生富 2018-06-07 10:21:23| 查看:
  猪细小病毒病是由猪细小病毒病(Porcine Parvovirus,PPV)感染引起以母猪繁殖障碍为主要特征的病毒性传染病。该病毒最早由Mary 和Mahncl 于1966 年发现,接着Cartwright 等在1967 年对猪的不孕、流产、死产等进行病原学研究时,从病料中分离出了猪细小病毒,从而首次证明了它的致病作用[1]。PPV 最早出现在欧洲,目前在世界上很多国家和地区流行,我国于80年代初开始研究此病,中国兽药监察所王在时1982年在国内率先分离到该病毒。血清学检测表明,在我国流行的PPV 属于同一血清型。近年来,PPV 感染呈扩大上升的趋势,给养猪业造成了巨大的经济损失。猪孕前期感染该病毒后,经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭,引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等;不同类型的猪均可感染,但除怀孕母猪外,其他类型的猪感染后均无明显临床症状。

 
新大牧业 王生富
    
  01
  
  PPV分型

  
  PPV仅有一个血清型,但按照致病力和组织嗜性可分为4个类:
  
  第1类以NADL-8株为代表,为强毒株,口服接种可以穿过胎盘屏障,导致胎儿感染,形成病毒血症;
  
  第2类以NADL-2为代表的弱毒株,口服接种不能穿过胎盘屏障,对妊娠母猪和胎儿无致病性,不形成病毒血症,可作弱毒疫苗株使用。若将NADL-2株通过子宫内接种,则病毒有复制和感染能力,并可导致胎儿死亡;
  
  第3类以Kresse株为代表,为皮炎型强毒株,可以致死免疫不充分的胎猪;第4类为肠炎型毒株,其主要引起肠道病变。
  
  由于序列-独立PCR(sequence-independent PCR)和高通量测序技术的发展,检测到新的细小病毒类型。上述1996年开始沿用的4种PPV类型全部归为PPV1型,属于细小病毒属。而PPV2型是2001年Hijikata等在缅甸进行戊型肝炎调查时从猪血清中发现,与番鸭细小病毒和牛细小病毒3相似,但从系统发育上却不同,与其他已知类型的细小病毒距离较远。2008年,新的细小病毒PHOV在香港确认,其基因组序列与人细小病毒4(PARV4)和牛(BHOV)密切相关,即PPV3,研究发现PPV3在英国和匈牙利的家猪、德国和罗马尼亚的野种中持续感染。PPV2和PPV3均属于香港病毒属(Hokovirus)。PPV4属于博卡病毒属(Bocavirus)在猪群中感染率和阳性率较低。
  
  02
  
  PPV 分子生物学特征、结构蛋白与功能

  
  PPV 病毒粒子外观呈六角形或圆形,无囊膜,直径20-23 nm,二十面体等轴立体对称。核衣壳由32 个壳粒组成,核心含单股线状负链DNA,核酸约占整个病毒粒子的26.5%,其G+C 含量为48 %。病毒粒子有两种形式存在,一种为完整病毒粒子,另一种仅有空衣壳粒子的存在,这2 种病毒粒子在氯化铯中的浮力密度分别为1.37-1.39 g/cm3 和1.30 g/cm3。该病毒具有较强的抵抗力。病毒在pH 3-9 之间较稳定,胰酶对病毒悬液的短时间处理,不但对其感染力无影响,而且能提高其感染效价。
  
  结构蛋白是PPV 的主要免疫原性抗原。PPV 基因组编码了3 种结构蛋白:VP1、VP2、和VP3,它们的分子量分别是84 kDa、64 kDa 和60 kDa。VP1 和VP2 许多氨基酸序列是重叠的。VP1 的N 端有一脯氨酸丰富区,该蛋白结构在病毒从细胞外转移到细胞内起到了重要的作用。VP1 蛋白也是PPV 复制和病毒粒子包装所必需的一种结构蛋白, VP1 蛋白还具有稳定病毒单链DNA 的作用,其N 端富含的碱性残基有助于单链DNA 与其结合,从而启动病毒的DNA 的复制与包装。VP2 是构成衣壳蛋白的主要成分,具有血凝活性,VP2 基因编码的多肽能自我装配成类病毒粒子,是良好的抗原转运载体,能诱导很强的细胞免疫。VP3 是VP2 翻译后切割加工的产物,它只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现。PPV 基因组编码三种非结构蛋白:NS1、NS2 和NS3,分子量分别是75.5 kDa, 18.1 kDa 和12.4 kDa。NS1 蛋白是感染PPV 中主要的非结构蛋白,其基因高度保守,蛋白具体功能还不很清楚。
  
  03
  
  流行病学

  
  本病常见于初产母猪,一般呈地方性流行或散发。本病广泛分布于世界各地。除了感染的公母猪外,受感染的大鼠是PPV 的另一个传染源。PPV 抗体阳性猪中30 %-50 %是带毒者。子宫内感染的仔猪至少可带毒9 周,有些具有免疫耐受性的仔猪可能终生带毒和排毒。被感染公猪的精细胞、精囊、附睾和副性腺都可分离出病毒,配种时易传染给母猪。病毒能经胎盘垂直传播,感染本病毒的母猪所产死胎、活胎及子宫分泌物均含有高滴度的病毒。母猪、育肥猪和公猪主要是通过被污染的饲料、环境,经呼吸道和消化道感染。PPV 能在牛、绵羊、豚鼠、猫、小鼠及大鼠体内增殖,其血清中含有抗PPV 的特异性抗体。随着养殖集约化的不断发展,一些流行病学调查表明,PPV 常与引起母猪繁殖障碍的其它病毒出现混合感染,混合感染的病毒包括PRV、PRRSV、CSFV、PCV2 [9]。最近的研究表明,对表现为PMWS 临床症状的猪群中进行病原体的检测时,除了普遍存在PCV2 外,PPV 病原体也被检测到[10, 11]。
  
  仔猪和母猪的急性感染通常表现为亚临床病例,但在其体内很多组织器官(尤其是淋巴组织)中均能发现病毒的存在。母猪在不同孕期感染时,可产生病毒血症引起繁殖障碍。在怀孕30-50 天内感染时,主要产木乃伊胎;怀孕50-60 天感染时多产死胎;怀孕70 天感染的母猪常出现流产症状;怀孕70 天以后感染,由于胎儿免疫系统的作用,多能正常生产,但母猪子宫内膜有轻度炎症,胎盘有部分钙化。本病还可引起母猪发情不正常、久配不孕等症状。对公猪的受精率和性欲没有明显影响。
  
  病理学变化主要取决于在妊娠胎儿感染病毒的不同阶段。胎儿没有免疫力之前感染PPV,可出现不同程度的营养不良,瘀血、水肿和出血,胎儿死亡后颜色变黑,并有脱水和木乃伊变化。镜检病变主要是多数组织和血管广泛的细胞坏死、炎症和核内包涵体等。胎儿对PPV 具有免疫反应能力后再受到感染时,不产生病变,镜检观察,可出现内皮细胞肥大和单核细胞浸润等病变。受感染的死胎在大脑灰质、白质和脑脊膜上可见到脑膜炎的病变,以外膜细胞、组织细胞和少量浆细胞增生形成血管套为特征的变化,是其最重要的病理变化。对于PMWS,特征性的显微病理损害表现为淋巴器官的肉芽肿性炎症和不同程度的淋巴细胞缺失,而其中的组织细胞增多,出现多核巨细胞。淋巴结的皮质及副皮质区显著扩张,淋巴细胞减少等方面。
  
  PPV病在全球流行,在我国普遍存在(见表1,2),感染公猪精液、精索、副皋、副性腺中可分离到PPV,配种时传给易感母猪,精液也可能在体外受到污染。公猪、育肥猪、母猪的感染大多是因为接触污染饲料和饮水,污染圈舍是的主要储藏所。在不同猪感染率各不相同(见表3)。
    
  南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室对保存的2008~2013 年期间的送检病料,进行猪细小病毒2 型( PPV2) 、PPV3、PPV4、猪类博卡病毒( Pbo-likeV) 和猪博卡病毒( PBoV) 感染的分子流行病学调查,结果显示阳性率依次为46. 4%、21. 1%、6. 8%、12. 3%和5. 5%。
  
  2008~2013 年期间,PPV2 的感染率不同,分别为45. 7% ( 16 /35) 、37. 1% ( 13 /35) 、45. 2% ( 19 /42) 、51. 0% ( 25 /49) 、44. 0% ( 37 /84) 和52. 4%( 33 /63) ,其变化趋势如图3所示。另外,PPV2 可在除胎儿期仔猪之外的各生长阶段的猪群中检测到,检出率依次为: 哺乳仔猪47. 1% ( 16 /34) 、保育猪72. 5% ( 37 /51) 、育肥猪73. 1% ( 19 /26) 和成年猪50. 0% ( 2 /4) 。PPV2 在各组织器官中的检出率也不尽相同,其中以肺脏( 62. 5%,70 /112 ) 为最高,肾脏( 0 /18) 为最低(见表4)。
    
  04
  
  诊断方法
  

  4.1 病毒的分离鉴定
  

  病毒的分离鉴定是最早应用于PPV 抗原检测的技术,一般选用流产、死胎和木乃伊胎儿(长度小于16 cm)的内脏作为病毒分离材料。目前用荧光抗体技术来检验细胞培养物中是否分离到病毒,但大于70 天的死胎、木乃伊胎和新生仔猪不宜送检。因此时它们的组织内已存在病毒抗体,从而干扰病毒的分离,影响检测结果。
  
  4.2 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验
  
  该方法是检测PPV 较为经典的方法。HA 可用于检查组织提取物中的病毒抗原,而HI 试验用于感染后的抗体检查,HI 试验只能证明有PPV 感染,但不能证明是否新近感染,通过检查双份血清可证明是否新近感染。该方法虽能快速、大量的诊断,但灵敏度低、特异性不强,只能作为辅助诊断方法。
  
  4.3 血清中和试验(SN)
  
  SN 是最经典、传统的血清学方法,用于检测中和抗体,它特异、敏感。其原理是利用被检血清的抗体中和PPV,然后根据培养细胞的病变情况来计算血清抗体的滴度。此方法比HI 敏感,但操作比较复杂,在低剂量时并不引起细胞病变,从而限制了该方法的使用。
  
  4.4 酶联免疫吸附试验(ELISA )
  
  ELISA 快速、简便、敏感。李斐等将含猪PPV VP2 蛋白主要抗原表位基因构建到原核表达载体形成重组质粒PET-VP2,并在大肠杆菌中表达, 并以纯化的表达产物为抗原,初步建立PPV 抗体的间接EL ISA 检测方法[16]。Qing L 等为了区分PPV 自然感染和疫苗接种的猪只,建立一种通过检测NS1 非结构蛋白的ELISA 方法[17]。血清检测表明,那些自然感染猪群的血清能与建立的NS1-ELISA 很好的反应,而那些来源于灭活疫苗免疫接种的猪群的血清并不能与建立的NS1-ELISA 起反应。建立的ELISA 方法能很好的区分PPV 野毒感染与灭活疫苗接种病毒。
  
  4.5 乳胶凝集试验(LAT)
  
  LAT 是用聚苯乙烯乳胶颗粒致敏PPV 抗原来检测血清。LAT 与HI 相比,具有简便、快速、经济等优点,尤其适合于临床上的现场检测,该方法的不足之处在于它所检测的抗体主要是IgM,因此只能用于疾病的定性诊断,不能进行血清抗体滴度的监测。
  
  4.6 免疫电镜试验
  
  此法通过制备标本,负染,可在电镜下直接看到Ag-Ab 的复合物,从亚细胞水平上定位Ag 和Ab。侯喜林等用此法,用免疫电镜在50 000倍下可清晰见到聚集成团的,大小不一的病毒颗粒,近似六角形,无囊膜,直径大小约20-22 nm。与血凝、琼扩、免疫电镜等检查结果相符。
  
  4.7 免疫荧光抗体技术
  

  该方法可直接镜检胎儿组织冰冻切片,也可以快速准确的检测出病毒抗原,也可以在病毒培养过程中,检查接种病毒的单层细胞,较HI 敏感,是一种特异性强、检出率高且快速的诊断方法。但是用免疫荧光直接法检测组织病料中的PPV 抗原时,因病毒粒子小,检出率较低。为提高检出率,董齐等用猪PPV高免血清与胎儿组织中PPV抗原形成特异的反应,再加兔抗猪IgG 荧光抗体,建立了间接免疫荧光诊断技术,5h内即可报告检验结果[18]。
  
  4.8 免疫胶体金技术
  
  免疫胶体金技术是以胶体金为标记物的一种新的免疫学测定方法。胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。曹三杰等建立了斑点免疫金染色法检测PPV抗体的方法,对PPV抗体检出量为1.008×10-10 g/mL [19]。
  
  05
  
  分子生物学诊断方法
  
  5.1 PCR 检测技术

  
  该方法特异性强、敏感性高、快速、方便,适合于大量样品的检测。Wilhelm S 等利用SYBR Green 标记建立起检测PPV 的实时定量PCR,该方法通过扩增VP2 基因并以猪的c-myc 基因为标准,具有很好的敏感性及特异性实验表明[20]。虽然PCR 方法快速、敏感,但是由于PPV 的广泛存在以及猪体感染病毒后长期带毒的现象,很难通过PCR 检测区别自然感染和疫苗株。
  
  5.2 核酸探针技术
  
  核酸探针技术具有快速、敏感、特异性强等优点,特别适用于疾病的早期诊断和鉴别诊断,是近二十年来应用较多的诊断技术。候喜林等、白红光等利用地高辛标记探针用于诊断PPV,两种标记探针对PPV 的最低检测量都达到了pg级,同时也具有很好的特异性,能够用于PPV 的病原体诊断[21, 22]。Kim J 等报道,用不同标记的PCV-2和PPV探针,同时检测患多系统衰竭综合征和实验接种猪的淋巴结及脾等组织,不仅可以同时诊断两种病原体,而且可进一步了解多系统衰竭综合征的发病机理[23]。
  
  06
  
  疫苗

  
  猪细小病毒病的防制以免疫预防为主(国内主要疫苗及毒株见表)。对从未发生过即感染的农场和地区,应杜绝引进病猪和带毒猪,对公猪精液进行检查,即阴性者方可使用。发病猪场,应特别防止母猪在初受孕时被感染,或把其配种期拖延到九月龄,此时母源抗体己消失,自动免疫力也产生。
  
  随着分子生物学技术的发展,采用基因重组DNA 技术,研制PPV 基因工程疫苗成为研究的热点。PPV VP2 基因是PPV 主要的衣壳蛋白,在体外表达时可自主装配, 能自动形成完整的病毒样颗粒, 并能自我装配成类病毒粒子,具有较好的免疫原性,成为病毒疫苗研究的主要方向。
  
  大肠杆菌是目前为止最为有效和方便的表达系统,司艳红等利用PCR 方法从病毒基因组中获得了VP2 完整的编码区并克隆到pET-32(a) 上,在大肠杆菌中进行原核表达,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清。此外,她还将VP2 基因克隆到pFastBacDUAL 载体上,利用昆虫表达系统对VP2 进行了表达,结果表明该蛋白能在昆虫细胞中形成类病毒颗粒,为研制PPV 的基因工程疫苗奠定了基础。
 
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